style="width:0.83324in;height:0.5335in" /> … … … … … … … …(A. 1) 本文是学习GB-T 31582-2015 牛性控冷冻精液. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了牛性控冷冻精液技术要求、抽样、试验方法、判定规则和标识、包装。
本标准适用于采用流式细胞分离技术生产牛性控冷冻精液。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 2828.2—2008 计数抽样检验程序 第2部分：按极限质量(LQ)
检索的孤立批检验抽样
方案
GB/T 2828.11—2008 计数抽样检验程序
第11部分：小总体声称质量水平的评定程序
GB 4143 牛冷冻精液
GB/T 5458 液氮生物容器
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
性控冷冻精液 frozen sexed-semen
分离后富含 X 精子或 Y 精子、经超低温冷冻后在液氮中长期保存的精液。
3.2
精子分离准确率 X or Y ratio of sexed-semen
X 精子或 Y 精子占分离后精子总数的百分率。
经审定或鉴定的公牛，体质健康，无遗传病，不允许有《中华人民共和国动物防疫法》中所明确的二
类疫病中的任何一种。
色泽乳白色或淡黄色，精子活力≥65%,精子密度≥4×10⁸个/mL, 精子畸形率≤15%。
细管无裂痕，两端封口严密。
GB/T 31582—2015
细管冷冻精液：微型，剂量≥0.18 mL。
≥35%(即≥0.35)。
≥80万个。
≥85%。
≤15%。
≤800个。
按照GB/T 2828.2—2008中第4章，采用极限质量 LQ=20, 模式 A
一次抽样方案，确定抽样公牛
样本量。
按照GB/T 2828.11—2008 中第6章，该群体公牛为一核查总体，采用DQL=10,
选用第 I 检验水
平的抽样方案；查GB/T 2828.11—2008中 表B.2,确定抽样公牛的样本量。
复检可根据原抽样方案确定，仲裁应按照5.1.2规定的方案进行抽样检验，按照7.4.2规定的方案
进行评定。
随机抽样。
用目测法，其结果应符合4.3.1的规定。
GB/T 31582—2015
检验按附录 A 中 A.2 规定的方法，其结果应符合4.3.2的规定。
检验按 A.3 规定的方法，其结果应符合4.3.5的规定。
精子活力、前进运动精子数、精子畸形率及细菌菌落数的检验按照 A.4～A.8
规定的方法，其结果
应分别符合4.3.3、4.3.4、4.3.6、4.3.7的规定。
对冷冻精液的单项目检验是型式检验的一部分，主要是在生产批入库前和销出库时的检验。
对冷冻精液全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准也是在生产方抽样检验、仲裁和质量监
督抽样检验时选定项的检验。
按照4.3.1和4.3.3的规定。
按照4.3.1～4.3.7的规定。
样品中任何一项目检验未达到4.3.1和4.3.3的规定要求，则判为不合格。
样品中任何一项目检验未达到4.3.1～4.3.7的规定要求，则判为不合格。
生产方抽样检验按照GB/T 2828.2—2008
中第4章的规定，通过对样本检验，若样本中不合格品
数等于或小于接收数 Ac, 则接收该批(合格),否则不接收该批(不合格)。
GB/T 31582—2015
按照GB/T 2828.11—2008 中规定，在样本中d (不合格品数)≤L
(不合格品限定数),即抽检样本
符合要求，核查通过；当d>L, 即抽检样本不符合要求，核查总体不合格。
种公牛的品种以代号表示，具体遵照GB4143 的规定。
应在细管壁和包装袋上印制以下内容，印制标识要清楚，并按以下顺序排列：
a) 生产单位代号；
b) 公牛品种；
c) 公牛注册号；
d) 生产日期或批次；
e) 分离精子标记：X 或 Y。
牛性控冷冻精液细管用塑料管包装，每个包装不得超过25剂。
GB/T 31582—2015
(规范性附录)
牛性控冷冻精液质量检验方法
A.1 抽 样
A.1.1 样品的收集
抽样：从贮存冷冻精液的液氮容器中按规定随机抽取样品。
送样：将抽取的样品送至质量检测机构。
A.1.2 抽样方案
A.1.2.1 生产方抽样检验
按5. 1. 1确定样本数。
A.1.2.2 质量监督抽样检验
按5. 1.2确定样本数。
A.1.2.3 抽样方法
按牛号顺序排列，由抽样人员现场按样本头数随机确定各样品公牛。
A.1.2.4 全部取样
对已投产的每头公牛取样。
A.1.3 取样方法
确定取样公牛，从贮存冷冻精液的液氮容器中随机抽取大于15剂的性控冷冻精液。
A.1.4 样品的保存
存放性控冷冻精液的液氮容器质量应符合 GB/T 5458
的规定，使用前经过清洗后加入液氮，样品
浸在液氮中。取放样品时在空气中暴露时间不得超过10 s。
由专人保管样品，样品不允许脱离液氮，抽
样登记单与样品随行。样品包装、标记应保持原样。
A.2 剂量检测
A.2.1 主要器材
小试管、剪刀、刻度吸管。
A.2.2 检测方法
取2剂细管性控冷冻精液自然解冻后剪去超声波封口端，把精液推入一小试管内，用1.0
mL 刻 度
吸管准确吸取精液，并读取总精液量。
GB/T 31582—2015
A.2.3 计算
样品的剂量值为2剂性控冷冻精液总剂量的平均值，按式(A.1) 计算：
style="width:0.83324in;height:0.5335in" /> … … … … … … … …(A. 1)
式中：
V— 剂量值，单位为毫升(mL);
n ——样品总剂量值，单位为毫升(mL)。
A.3 X 精子或 Y 精子分离准确率的检测
A.3. 1 机器检测方法
A.3. 1. 1 主要器材
流式细胞仪或精子纯度检测仪、循环恒温水浴锅、超声波发生器、5 mL
试管、移液器、0.22μm 过滤
器、50μm 过滤器。
A.3.1.2 主要试剂及配制方法
主要试剂及配制方法如下：
a) 荧光染料 Hochest 33342(0.05%):将10 mg 荧光染料 Hochest 33342
定容于20 mL 双蒸水 中，在5℃条件下避光保存，有效期90 d;
b) Tris-sheath 工作液(pH 8.0):取 Tris 4.776 g,柠檬酸2.326
g、D-果糖1.710 g 溶于120 mL 双 蒸水中搅拌至完全溶解，用4 mol/L 的 NaOH
将 pH 值调到8.0,用双蒸水定容至200 mL。 该液用0.22 μm
的过滤器过滤灭菌后添加国产青霉素2万单位、国产链霉素1万单位，置5℃
冰箱保存，有效期14 d 。该液渗透压290 mOsm±10 mOsm。
注：以上化学试剂纯度均为分析纯。
A.3. 1.3 检测方法
在 5 mL 试管里，先加20μL 荧光染料 Hochest 33342(0.05%),再加1 mL
Tris-sheath 工作液
(pH8.0) 充分混匀，最后将解冻后精液加入管内，精液体积范围30μL～100μL 。
混匀后放入34 ℃水 浴锅水浴20 min
。取出染好的精液，用超声波发生器断去精子尾部后，用50μm 过滤器过滤到5
mL 试
管中。处理好的精液放置避光处。
开启流式细胞仪，作好仪器图像定位。将处理好的精液放入加样器，按照流式细胞仪精子纯度检测
操作流程，检测上述染色样品。重复以上操作3次，取其平均值。
染色后样品应在4 h 内检测完毕。
3次检测数据误差值大于5%时，应重新操作。
A.3. 1.4 计算
X 精子的分离准确率按式(A.2) 计算：
style="width:2.32004in;height:0.61996in" /> … … … … … … … …(A.2)
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式中：
A — X 精子性控平均分离准确率，%;
A₁——X 精子性控第1次检测分离准确率，%;
A₂— X 精子性控第2次检测分离准确率，%;
A。 —X 精子性控第3次检测分离准确率，%。
A.3.2 精子特异性 DNA 探针检测方法
A.3.2.1 主要器材
荧光显微镜、培养箱、干燥箱、干浴器、移液器。
A.3.2.2 主要试剂及配制方法
主要试剂及配制方法如下：
a) PBS: 取袋装 PBS 干粉用1000 mL 双蒸水稀释，室温保存；
b) Y 精子特异性 DNA 探针， -20℃保存；
c) 10% 胃蛋白酶：称0.1 g 胃蛋白酶加1mL 双蒸水(提前预热到37℃),25 μL
分装， -20℃ 保存；
d) 0.005% 胃蛋白酶：25 μL 的10%胃蛋白酶加入49.5 mL 双蒸水以及0.5
mL1.0 mol/L 的盐
酸，37℃水浴；
e) Solution A:称取0.121gTris 碱和0.9 g NaCl溶于100 mL
双蒸水，充分混匀，4℃保存备用；
f) Solution B:称取0.3856 g DTT溶于1 mL 精子洗涤液，充分吸打混匀，
-20℃保存备用；
g) Solution C:称取1 gSDS 和1.9g 四硼酸钠溶于100 mL
双蒸水中，反复颠倒混匀，室温保存
备用；
h) 20×SSC: 称取87.6 g NaCl,44.1g 柠檬酸钠，溶于500 mL
双蒸水中(用盐酸将 pH 调到 7.0),高压灭菌，4℃保存备用；
i) 2×SSC 溶液(pH7.0): 在一个量筒里量出100mL 的20×SSC 溶液，与约880 mL
的双蒸水混 合，用1 mol/L 的 HCl 溶液将pH 调到7.0,用双蒸水将溶液定容到1
L, 高压灭菌，室温下存 储。如果有任何可见的沉淀，就要丢弃溶液；
j) 0.4×SSC 溶液(pH 7.0):20mL 的20×SSC 溶液与约970 mL 双蒸水混合，用1
mol/L 的 HCl 溶液使pH 下降到7.0,用双蒸水使液体量达到1 L,用 1 mol/L 的
HCl 将 pH 调到7.0, 用双蒸水将溶液定容到1 L,
高压灭菌，室温下存储，如果有任何可见的沉淀，就要丢弃溶液；
k) 0.4×SSC 溶液，pH7.0/0.3% NP-40:50mL 的0.4×SSC(pH 7.0)加上150 μL 的
NP-40, 均 匀混合；
1) 2×SSC 溶液， pH 7.0/0.1% NP-40:50mL 的 2 ×SSC(pH 7.0)加上50μL 的
NP-40, 均匀 混合；
m) 1 mol/L甘氨酸(pH 8.5):7.05g甘氨酸加入100 mL 双蒸水，室温保存；
n) 甲醛固定液：依次取12.5 mL10% 中性甲醛，37 mLPBS,2.5 mL1 mol/L
MgCl₂ ,混合均匀。 室温保存；
O) DAPI。
注：以上化学试剂纯度均为分析纯。
A.3.2.3 检测方法
取一剂细管牛性控冷冻精液置37℃水浴解冻，推入1.5 mL 试管中，精子用溶液 A
离心洗涤后将
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其浓度调至2.5×10°/mL, 依次使用溶液 B、溶 液
C、无水乙醇处理精子使其解凝聚，然后滴片、烘干。
烘干后的片子在冰箱中放置过夜，隔天取出片子晾干后，首先在2×SSC(pH
7.0)孵育，然后用胃蛋白酶 溶液消化，消化后的片子用1×PBS
冲洗，甲醛固定，最后用70%、85%、100%乙醇处理。将处理好的精
子玻片上滴上精子特异性 DNA 探针封片，杂交过夜。隔天在0.4×SSC 溶液(0.3%
NP-40) 溶液中除 去封片胶，在2×SSC(0.1%
NP-40)溶液中除去盖玻片，最后依次使用0.4×SSC 溶 液(pH 7.0)、2× SSC 溶
液(pH7.0) 溶液洗片，片子风干后滴上 DAPI
在显微镜下计数。统计具有蓝色荧光的总精子数 和绿色杂交点的 Y
精子数。每次检测2张带有精子样品的载玻片，每张载玻片计数200个左右的精
子，最后计算出总数。
A.3.2.4 计 算
X 精子的分离准确率按式(A.3) 计算：
style="width:2.44008in;height:0.68002in" /> … … … … … … … …(A.3)
式中：
A——X 精子性控分离准确率，%;
Y— Y 精子数，单位为个；
T— 总精子数，单位为个。
A.4 精子活力的检测
A.4. 1 主要仪器和器材
相差显微镜、电视显微系统、计算机、恒温水浴箱、5.0 mL
试管、载玻片或精液性状板、盖玻片、显微
镜恒温装置、移液器。
A.4.2 检测方法
2剂细管性控冷冻精液分别直接置于37℃水浴中解冻，取解冻后混合精液约20 μL
置于载玻片
上，加盖玻片后立即在200倍～400倍相差显微镜或电视显微系统上观察活力，载物台温度保持38℃,
每个样品观察3个视野。
A.4.3 计 算
精子活力是3个视野精子活力评价值的平均数，按式(A.4) 计算：
style="width:2.19338in;height:0.61336in" /> … … … … … … … …(A.4)
式中：
M—— 精子活力，%;
n₁— 第一视野活力评价值，%;
n₂—— 第二视野活力评价值，%;
n3—— 第三视野活力评价值，%。
A.5 每剂量中精子总数检测
A.5. 1 主要器材
血球计数板、血色素管、1 mL
刻度吸管、小试管、计数器、移液器、显微镜或电视显微系统。
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A.5.2 检测方法
准确吸取20μL 解冻后精液，注入盛有0.98 mL
的3.0%氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为
50倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用移液器吸取稀释精液于血盖片
边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满，在显微镜下或电视显微系统上观察计数。
A.5.3 计算
每剂量中精子总数按式(A.5) 计算：
S=Q×104×50×V … … … … … … … …(A.5)
式中：
S— 每剂量中精子总数，单位为个；
Q—— 计数室25个中方格的总精子数，单位为个；
V— 剂量值，单位为毫升(mL)。
每样品观察上下两个计数室，取平均值，如两个计数室计数结果误差超过5%,则应重检。
A.6 每剂量中呈前进运动精子数
每剂量中呈前进运动精子数按式(A.6) 计算：
C=SXM
式中：
C— 每剂量中前进运动精子数，单位为个；
S—— 每剂量中精子总数，单位为个；
M—— 精子活力，%。
A.7 精子畸形率的检测
A.7. 1 主要器材
显微镜、载玻片、血球分类计数器、染色板、吸管。
A.7.2 主要试剂及配制
A.7.2. 1 磷酸盐缓冲液
………… ……… (A.6)
取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄ ·2H₂O)0.55
至100 mL。
A.7.2.2 中性福尔马林固定液
取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄ ·2H₂O)0.55 钠约50.0 mL 溶解后加入8.0 mL40%
液定容至100.0 mL。
A.7.2.3 姬姆萨原液
g、磷酸氢二钠(Na2HPO₄ · 12H₂O)2.25 g,双蒸馏水定容
g、磷酸氢二钠(Na₂HPO · 12H₂O)2.25 g,用0 . 89%氯化
甲 醛 HCHO (使用前经碳酸镁中和过滤),再加0.89%氯化钠溶
分别用量筒量取甘油[C3H;(OH)₃]66.0 mL、甲 醇(CH₃OH)66.0
mL。将姬姆萨染料1.0 g 放 入
研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部加入并置60℃恒温箱中，溶解4
h 后，再加
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入甲醇充分溶解，过滤后贮于棕色瓶中待用，贮存时间越久染色效果越好。
A.7.2.4 姬姆萨染液
取姬姆萨原液(A.7.2.3)2.0mL, 加磷酸盐缓冲液3.0 mL 及蒸馏水5.0 mL 。
现配现用。
以上所用化学试剂纯度应达到分析纯。
A.7.3 制片染色、镜检、计算
A.7.3. 1 抹片
取解冻后精液1滴，滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片成35°夹角，将样
品均匀地拖布于载玻片上，自然风干(约5 min), 每样品制作2个抹片。
A.7.3.2 固定
在已风干的抹片上滴1.0 mL～2.0mL 中性福尔马林，固定15 min
后用清水缓缓冲去固定液，吹干
或自然风干。
A.7.3.3 染色
将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间。让其充满
平槽并使抹片接触染液，染色1.5 h 后用清水缓缓冲去染液，晾干待检。
A.7.3.4 镜检
将制备好的抹片在显微镜(400倍～600倍)下观察，每个抹片观察200个以上的精子(分左、右2个
区),取2片的平均值，2片的变异系数不得大于20%,若超过应重新制片。
A.7.3.5 计算
精子畸形率按式(A.7) 计算：
style="width:1.73318in;height:0.60654in" /> ……… … …… (A.7)
式中：
A —— 精子畸形率，%;
A₁— 畸形精子数，单位为个；
S —— 精子总数，单位为个。
A.8 细菌菌落数的检测
A.8. 1 主要器材
培养箱、超净化工作台、天平、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、培养皿。
A.8.2 培养基的配制
普通琼脂的制作：取牛肉浸膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄ ·
3H₂O)1.0g 、 氯化钠
(NaCl)5.0g, 用蒸馏水1000 mL 溶解后加琼脂粉20 g 加温融解。调整 pH
至7.4～7.6,并用脱脂棉过
滤，分装于三角烧瓶中经高压灭菌(0.1 MPa,20 min)。
也可使用营养琼脂培养基。
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A.8.3 检测方法
将每份样品制作灭菌平皿2个并标注样品号。取2剂细管性控冷冻精液在37℃水浴中解冻，细管
用酒精棉球消毒后分别注于2个灭菌平皿内；在无菌条件下，把50℃~52℃的培养基倒入平皿内，每
平皿15 mL,
并水平晃动平皿使精液混合均匀，待琼脂凝固后倒置平皿，同时作空白对照平皿，置37℃
恒温箱内培养48 h 取出，统计出每个平皿内细菌菌落数。
A.8.4 计 算
样品的细菌菌落数为2个平皿中统计菌落数的平均值，按式(A.8) 计算：
style="width:1.50002in;height:0.59334in" /> …… …………… (A.8)
式 中 ：
B — 细菌菌落数，单位为个；
ni ——第1个平皿菌落数，单位为个；
n₂—— 第2个平皿菌落数，单位为个。
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